Министерство здравоохранения Республики Беларусь

Учреждение образования

«Гомельский государственный медицинский университет»

Кафедра биологической химии

Обсуждено на заседании кафедры биологической химии

Протокол № __________

МЕТОДИЧЕСКАЯ РАЗРАБОТКА

Для проведения занятия со студентами

2 курса ФПСЗС
по
биологической химии

(наименование дисциплины)

Тема: Белки 5. Биосинтез белка. Регуляция биосинтеза. Патология белкового обмена.

Время 3ч.


1. УЧЕБНЫЕ И ВОСПИТАТЕЛЬНЫЕ ЦЕЛИ, МОТИВАЦИЯ ДЛЯ УСВОЕНИЯ ТЕМЫ; ТРЕБОВАНИЕ К ИСХОДНОМУ УРОВНЮ ЗНАНИЙ.

Цель занятия: сформировать представления об этапах биосинтеза белка, механизмах его регуляции и молекулярных аспектах основных нарушений азотистого обмена. Освоить рефрактометрический метод определения концентрации белка в сыворотке крови.


В результате проведения занятия студент должен:

1) Знать принципиальную схему, этапы, молекулярный механизм и регуляцию процесса биосинтеза белка; биохимические основы и последствия нарушений белкового обмена.

2) Научиться проводить исследование на рефрактометре.



2. КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ ИЗ СМЕЖНЫХ ДИСЦИПЛИН.

2.1. Строение, классификация и свойства основных классов нуклеиновых кислот (биоорганическая химия).

2.2. Строение рибосом (медицинская биология).

2.3. Структура и функции иммуноглобулинов (микробиология).


3.КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ ПО ТЕМЕ ЗАНЯТИЯ.


1. Принципиальное отличие биосинтеза белка от биосинтеза других молекул. Общая схема биосинтеза белка - необходимые предпосылки:

1.1. информационный поток - схема передачи информации (центральная догма молекулярной биологии). Репликация и транскрипция ДНК - ферменты, механизм. Обратная транскрипция, роль ревертаз. Процессинг и сплайсинг иРНК. Характеристика генетического кода, кодон, антикодон.


Отличие биосинтеза белка от биосинтеза других молекул:


Общая схема биосинтеза белка - необходимые предпосылки:


Схема передачи информации (центральная догма молекулярной биологии).



Поток генетической информации идет в следующем направлении:

Первый шаг, копирование информации с ДНК на РНК, назван транскрипцией, что ассоциируется с работой средневековых монахов, проводивших свою жизнь в кельях за копированием символ за символом, старых латинских рукописей.

Второй шаг, при котором аминокислоты полимеризуются согласно информации, записанной в РНК, назван трансляцией. Продолжая аналогию с жизнью монахов, этот процесс напоминает работу других монахов (уже много столетий спустя), которые, пользуясь переписанными прежде рукописями, находят эквиваленты старых латинских слов на других языках (например, белорусском или английском) и создают новые рукописи, написанные на отличающемся от исходного языке, в данном случае на языке аминокислотной последовательности.

Ретровирусы внесли изменения в центральную догму молекулярной биологии: особой формой репликации у прокариот является репликация с использованием РНК в качестве матрицы для синтеза ДНК (такая форма репликация обнаружена у HIV ретровируса, вызывающего СПИД) и катализируется ферментом РНК зависимой ДНК полимеразой или обратной транскриптазой (ревертазой).

Процессинг и сплайсинг иРНК.

См в теме белки-4, вопрос 11.


Характеристика генетического кода, кодон, антикодон.


Генети́ческий код - это свойственный всем живым организмам способ кодирования аминокислотной последовательности белков при помощи последовательности нуклеотидов.

Таблица генетического кода

1

2

3

У

Ц

А

Г


У


Фен

Сер

Тир

Цис

У

Фен

Сер

Тир

Цис

Ц

Лей

Сер

Терм

Терм

А

Лей

Сер

Терм

Три

Г


Ц

Лей

Про

Гис

Арг

У

Лей

Про

Гис

Арг

Ц

Лей

Про

Глн

Арг

А

Лей

Про

Глн

Арг

Г


А

Иле

Тре

Асн

Сер

У

Иле

Тре

Асн

Сер

Ц

Иле

Тре

Лиз

Арг

А

Мет

Тре

Лиз

Арг

Г


Г

Вал

Ала

Асп

Гли

У

Вал

Ала

Асп

Гли

Ц

Вал

Ала

Глю

Гли

А

Вал

Ала

Глю

Гли

Г


Свойства генетического кода:

  1. Триплетность — значащей единицей кода является сочетание трёх нуклеотидов (триплет, или кодон).

  2. Непрерывность — между триплетами нет знаков препинания, то есть информация считывается непрерывно.

  3. Неперекрываемость — один и тот же нуклеотид не может входить одновременно в состав двух или более триплетов.

  4. Однозначность — определённый кодон соответствует только одной аминокислоте.

  5. Вырожденность (избыточность) — одной и той же аминокислоте может соответствовать несколько кодонов.

  6. Универсальность — генетический код работает одинаково в организмах разного уровня сложности — от вирусов до человека.


Антикодон – триплет, занимающий определенное и постоянное положение в структуре тРНК, комплементарно взаимодействует с кодоном иРНК.


1.2. пластический поток - механизм активации аминокислот, строение тРНК, характеристика АРС-аз - кодаз.


  1. Этап активирования аминокислот:

Процесс трансляции начинается с активирования аминокислот, в котором участвуют тРНК, аминокислоты и специфические ферменты аминоацил-т-РНК синтетазы (АРСазы).

На первом этапе аминокислота взаимодействует с АТФ, образуя промежуточное соединение аминоацил-аденилат. АТФ распадается при этом с образованием пирофосфата, гидролиз которого делает этот этап необратимым. На втором этапе аминокислота в активном центре АРСазы переносится на тРНК с образованием связи между СООН группой аминокислоты и 2’или 3’ ОН группами рибозы концевого аденилового нуклеотида акцепторного участка тРНК. Узнавание соответствующей тРНК связано с особенностями нуклеотидного состава всей молекулы тРНК (не только структуры антикодона).

1.3. энергетический поток. Роль макроэргов АТФ, ГТФ и др. в биосинтезе белка.

Роль АТФ:

Аминокислота+АТФ+тРНК+Н2О = аминоацил-тРНК+АМФ+ФФн

Роль ГТФ:

Рибосомы - принципы организации, строение, состав. Механизм трансляции - этапы рибосомального цикла:

2.1. инициация, факторы инициации. Образование инициаторного комплекса.

2.2. элонгация, факторы элонгации.

2.3. терминация.


Рибосомы - принципы организации, строение, состав.


Рибосомы, внутриклеточные частицы, осуществляющие биосинтез белка, состоят из двух различных субчастиц, каждая из которых построена из рибосомной РНК [рРНК (rRNA)] и многих белков. Рибосомы и их субчастицы обычно классифицируют не по массам, а в соответствии с коэффициентами седиментации. Коэффициент седиментации полной эукариотической рибосомы составляет около 80 единиц Сведберга (80S), а коэффициент седиментации ее субчастиц составляет 40S и 60S.

Меньшая 40S-субчастица состоит из одной молекулы 18S-рРНК и 30-40 белковых молекул. Большая 60S-субчастица содержит три типа рРНК с коэффициентами седиментации 5S, 5,8S и 28S и 40-50 белков. В присутствии мРНК (mRNA) субчастицы объединяются с образованием полной рибосомы, молекула мРНК проходит через щель на малой субчастице, причем эта щель ориентирована как раз в промежуток между двумя субчастицами. тРНК также связываются вблизи этого участка.

Рибосомы прокариот имеют аналогичную структуру, но они несколько мельче, чем эукариотические (коэффициенты седиментации полной рибосомы 70S, а субчастиц — 30S и 50S).

В процессе функционирования (т. е. синтеза белка) рибосома осуществляет несколько функций:

1) специфическое связывание и удержание компонентов белоксинтезирующей системы [информационная, или матричная, РНК (иРНК); аминоацил-тРНК; пептидил-тРНК; гуанозинтрифосфат (ГТФ); белковые факторы трансляции еEF;

2) каталитические функции (образование пептидной связи, гидролиз ГТФ):

3) функции механического перемещения субстратов (иРНК, тРНК), или транслокации. Функции связывания (удержания) компонентов и катализа распределены между двумя рибосомными субчастицами:

  1. связывая мРНК, служит первичным акцептором генетической информации для белоксинтезирующего аппарата;

  2. с участием факторов инициации обеспечивает узнавание инициирующего участка на иРНК путем сканирования цепи мРНК [у эукариот];

  3. обеспечивает кодон-антикодоновое взаимодействие инициирующего кодона иРНК с антикодоном инициирующей тРНК;

Малая рибосомная субъединица таким образом, является главным " действующим лицом " всего сценария инициации и, по-видимому, не несёт каталитических функций.


Рибосома имеет 2 центра связывания: Р-центр (пептидильный) и А-центр (аминоацильный)


Механизм трансляции - этапы рибосомального цикла:


Собственно трансляция проходит в три этапа: инициация, элонгация и терминация.

  1. Инициация: (на рисунке шаг 2) молекула иРНК поступает на малую рибосомную субъединицу, рибосома точно присоединяется к модифицированному (кэп) 5’-концу иРНК и перемещается по ней до тех пор, пока не обнаружит инициирующий кодон, к инициирующему кодону (АУГ) присоединяется первая аминоацил-тРНК (метионил-тРНК), и комплекс «закрывается» большой субъединицей рибосомы. В образовании инициирующего комплекса участвуют белковые факторы инициации (еIF-1,2,3) [Initiation Factors] и используется энергия ГТФ.

  2. Элонгация: (на рисунке шаг 3) в аминоацильный участок поступает следующая аминоацил-тРНК. Фермент пептидилтрансфераза образует пептидную связь между активированной карбоксильной группой первой аминокислоты и аминогруппой второй аминокислоты. Образованный при этом дипептид «зависает» в аминоацильном центре. Затем с помощью транслоказы и энергии ГТФ рибосома перемещается по иРНК на один кодон, аминоацильный участок освобождается, туда поступает новая аминокислота. В стадии элонгации принимают участие белковые факторы элонгации (еEF). Таким образом, при элонгации рибосома работает как лентопротяжный механизм, перемещая с помощью тРНК цепь мРНК относительно себя с шагом по три нуклеотида от 5'- к 3'-концу цепи.

  3. Терминация (на рисунке шаг 4) наступает тогда, когда в аминоацильном участке оказывается один из терминирующих кодонов УАА, УГА, УАГ. К таким кодонам присоединяются специальные белки факторы терминации (рилизинг-факторы, release factors) еRF, которые высвобождают синтезированный пептид и вызывают диссоциацию субъединиц рибосомы.


На рисунке шаг 4 - посттрансляционная модификация белка: формирование пространственной структуры и процессинг белковой молекулы с целенаправленным перемещением молекул к местам их функционирования.


Некоторые факторы трансляции эукариот

Факторы эукариот

Функции

Инициация

еIF1

Участвуют в образовании инициирующего комплекса

eIF2

eIF3, eIF4C

eIF4E

Участвует в связывании кэпа иРНК

eIF4A, eIF4B,eIF4F

Участвуют в поиске первого кодона АУГ

eIF5

Способствуют диссоциации eIF2, eIF3, eIF4C

eIF6

Способствует диссоциации 60S субъединиц

Элонгация

eEF1a

Доставляет аминоацил тРНК к рибосоме

eEF1bg

Участвует в рециклизации eEF1a

eEF2

Фактор транслокации

Терминация

eRF

Завершает синтез полипептидной цепи


3. Виды и механизмы посттрансляционной модификации (процессинга) пробелков:

3.1. химическая модификация (виды, примеры);

3.2. ограниченный протеолиз;

3.3. самосборка белка.


Многие белки синтезируются в неактивном виде (в виде предшественников) и после схождения с рибосом подвергаются постсинтетической модификации. Виды модификации белков:

  1. частичный (ограниченный) протеолиз (удаление N-концевого метионина и сигнального пептида, образование активных форм ферментов и гормонов, смотри ниже в вопросе 3.2)

  2. ацетилирование: в большинстве случаев инициирующий метионин удаляется путем гидролиза, и к новой N – концевой аминокислоте добавляется ацетильная группа. АцетилoA – донор ацетильной группы для этих реакций. Ацетилированию подвергаются гистоновые белки.

  3. метилирование происходит по остаткам лизина в некоторых белках типа калмодулина и цитохрома c. S-аденозилметионин - донор активной метильной группы

  4. фосфорилирование - одна из наиболее популярных модификаций белков, которые происходят в животных клетках. Реакции фосфорилирования белков составляют часть механизмов регуляции биологической активности белка и являются обратимыми. Реакции фосфорилирования (АТФ + белок фосфопротеин +АДФ) катализируются протеинкиназами, а реакции отщепления остатков фосфата (фосфопротеин протеин + фосфат) протеинфосфатазами. Примером такого рода реакций могут быть реакции фосфорилирования гликоген синтазы и гликоген фосфорилазы в гепатоцитах в ответ на действие глюкагона – гормона поджелудочной железы. Фосфорилирование синтазы ингибирует ее активность, в то время как активность фосфорилазы повышается. Эти два синхронные события ведут к повышению поступления печеночной глюкозы в кровь. Наоборот, дефосфорилирование вызывает обратное соотношение активностей и клетки печени активно синтезируют гликоген.

  5. остатки тирозина в некоторых белках могут сульфатироваться. Примерами таких белков могут быть фибриноген или гастрин. Донором сульфата для белков, как и при сульфатировании других молекул является 3 '-фосфоаденозил-5 '-фосфосульфат (ФАФС). Присоединение сульфата к остаткам тирозина необходимо для проявления функции белков и является необратимым процессом в отличие от фосфорилирования тирозина, используемого в регуляторных механизмах клетки.

  6. Пренилирование - присоединение 15 углеродной фарнезильной или 20 углеродной геранилгеранильной групп к акцепторным белкам. Фарнезил и геранилгеранил - изопреноиды, получаемые на пути синтеза холестерина. Изопреноидные группы присоединяются к остаткам цистеина на С конце белков тиоэфирной связью (C-S-C). Последовательность на C - конце белков, подвергающихся пренилированию: CAAX, где C – цистеин, А – любая алифатическая аминокислота (кроме аланина) и X - C-концевая аминокислота. Для проведения реакции присоединения пренильных групп, три С- концевые аминокислоты молекулы предшественника (AAX) удаляются, а цистеин активируется метилированием при участии S-аденозилметионина как донора метильной группы. Примерами пренлированных белков могут служить белки, связывающие и гидролизуюшие ГТФ. Многочисленные G-белки участвующие в передаче сигналов имеют гамма субъединицу, модифицированную геранил-геранилом.

  7. Модификации белков, которые зависят от витамина C как кофактора, включают гидроксилирование пролина и лизина. Гидроксилирующие ферменты - пролилгидроксилазы и лизилгидроксилазы. (см. тему «Белки-2» вопрос 1.1.)

  8. Витамин К – кофактор в карбоксилировании остатков ГЛУ. Результатом этой реакции является -карбоксиглутаминовая кислота.

Это соединение важно для функции ряда белков, участвующих в свертывании крови. Образование глутамата позволяет белкам формировать комплексы с ионами кальция и таким образом способствовать изменению конформации и биологической активности белков. Антикоагулянты производные кумарина, варфарин и дикумарин, ингибируют реакцию


Ограниченный протеолиз;

Большинство белков подвергается действию протеаз. Самая простая форма такого протеолиза - удаление инициирующего метионина. Многие белки синтезируются в форме неактивных предшественников, активирование которых происходит порой далеко от места их синтеза при помощи так называемого ограниченного протеолиза. Примерами могут служить секретируемые ферменты поджелудочной железы или ферменты системы свертывания крови. Неактивные предшественники таких белков, активируемых удалением дополнительных пептидов, названы пропротеинами. Термин препротеины используется для обозначения белков, содержащих сигнальные последовательности, которые также удаляются специфическими протеазами. Многие секретируемые белки (пропротеины) также имеют сигнальные последовательности. Для обозначения таких белков используют термин препропротеины. Посттрансляционный протеолиз в в ряде случаев может принимать сложный характер. Например, препроопиомеланотропин, синтезируемый гипофизом, или препроинсулин.


Самосборка белка.


Через какое-то время после начала трансляции N-концевая часть растущего полипептида оказывается вне рибосомы и затем по мере роста полипептида все большая часть его свешивается с рибосомы в окружающую среду. В ней полипептидная цепь не может оставаться в виде развернутой цепи: ее гидрофобные боковые группы взаимодействуют друг с другом, а гидрофильные - с окружающей водой и ионами. Это создает условия для сворачивания, компактизации и самоорганизации внерибосомной части растущего полипептида в пространственную (вторичную и третичную) структуру.

Такое постепенное полярное сворачивание растущей полипептидной цепи на рибосоме обозначается как котрансляционное формирование структуры белка. В других случаях белок, синтезируемый рибосомой и используемый в других компартментах клетки необходимо перенести через мембрану либо вне клетки, либо в одну из внутриклеточных органелл. Транспорт такого белка через мембрану требует несвернутого состояния его полипептидной цепи. В этом случае могут быть использованы две альтернативные возможности:

1) рибосомы, синтезирующие белок, предназначенный для транспорта через мембрану, сами сидят на мембране (мембраносвязанные рибосомы), и растущий полипептид в развернутом виде поступает из них непосредственно в мембрану;

2) свободные (не прикрепленные к мембране) рибосомы цитоплазмы синтезируют полипептидную цепь, которая по мере выхода из рибосомы взаимодействует со специальными белками - молекулярными шаперонами. Шапероны препятствуют полному сворачиванию белка в компактную структуру и поддерживают его недосвернутое состояние в растворе. После освобождения из рибосомы эти недосвернутые белки взаимодействуют с мембраной и транспортируются через нее.


  1. Регуляция биосинтеза белка у прокариот. Особенности регуляции биосинтеза белка у эукариот:

4.1. избирательная транскрипция.

4.2. альтернативный сплайсинг иРНК.

4.3. модификация гистоновых и негистоновых белков.


Регуляция биосинтеза белка у прокариот.


Значительная часть белков одинакова для всех типов клеток. Они обеспечивают основные функции клеток (ферменты гликолиза, цикла Кребса, структурные белки). Скорость их образования и содержание в клетке обычно меняется незначительно. Такие белки получили название конститутивных белков. Существуют белки, потребность в которых возникает только в специальных условиях. Такие белки обычно синтезируются с очень низкой скоростью, но синтез их может быть значительно ускорен. Например, при голодании или усиленных физических упражнениях клетки печени начинают активно превращать аминокислоты в глюкозу. Это становится возможным благодаря усилению синтеза ферментов, катализирующих образование глюкозы из аминокислот. Такие белки получили название индуцируемых белков. Индукция свойство клеток синтезировать определенные ферменты только при наличии соответствующих субстратов.

Молекулярный механизм индукции ферментов был разработан Жакобом и Моно и известен как гипотеза оперона. У прокариот регуляция инициации транскрипции – основное место действия регуляторов.

Оперон - участок ДНК, кодирующий строение белков, содержит регуляторную зону, контролирующую синтез этих белков. Структурные гены располагаются на молекуле ДНК рядом с последовательностями нуклеотидов, называемых промотором и оператором. Для регуляции транскрипции необходим еще один участок ДНК - регуляторный ген, не всегда располагающийся вблизи вышеописанной группы. Во время транскрипции РНК-полимераза связывается с промотором и продвигается вдоль ДНК, образуя транскрипт генов оперона. Белки-репрессоры - продукты трансляции регуляторных генов, связываются с соответствующими операторными участками и блокируют продвижение РНК-полимеразы, и, следовательно, препятствуют транскрипции.

В самом простом варианте этот механизм можно рассмотреть на примере триптофанового оперона кишечной палочки. Оператор триптофанового оперона представляет собой последовательность нуклеотидов, которую узнает репрессор этого оперона. Присоединение репрессора блокирует присоединение РНК-полимеразы к промотору, предотвращая экспрессию триптофанового оперона. Присоединение репрессора к оператору становится возможным лишь в том случае, если к репрессору присоединятся 2 молекулы триптофана. Результатом данного взаимодействия оператора и репрессора является остановка синтеза. Такое влияние продукта гена регулятора получило название негативного контроля, гены, кодирующие такие регуляторы, названы генами репрессоров, а молекулы, способствующие такой реакции репрессора, получили название корепрессоры (в нашем случае это молекулы триптофана). Роль корепрессоров в клетке часто выполняют конечные продукты метаболических путей.


Особенности регуляции биосинтеза белка у эукариот. Избирательная транскрипция.


У эукариот, регуляция экспрессии генов происходит на разных участках механизма синтеза белков, начиная от синтеза иРНК и до формирования пространственной структуры белков. Можно выделить несколько уровней такой регуляции:

1 Регуляция механизмов траскрипции;

2. Регуляция процессинга иРНК;

3. Регуляция транспорта РНК из ядра в цитозоль;

4.Регуляция трансляции;

5.Регуляция стабильности (продолжительности жизни) иРНК;

Основным объектом регулирующего влияния на синтез белка и нуклеиновых кислот является транскрипция, она регулируется специальными регуляторными белками, которые присоединяются к специфическим последовательностям, как правило, расположенным на больших расстояниях от промотора. Влияние на процесс формирования комплекса инициирующих белков может быть ускоряющим (энхансеры) или замедляющим (сайленсеры).

Важным элементом в механизмах регуляции экспрессии генов на уровне транскрипции является доступность участков ДНК к действию регуляторов транскрипции.

Многие гены, используемые для синтеза белков, собраны в молекулах ДНК в форме кластеров и доступность к такому кластеру может быть в свою очередь регулируема. Предполагается несколько механизмов, позволяющих вызвать изменения хроматина. Включение или выключение отдельных кластеров генов в определенные сроки жизни клетки или организма обеспечивают процессы дифференцировки клеток, адаптации к определенным условиям жизни.

Альтернативный сплайсинг иРНК.


См. тему «Белки-4», вопрос №11


Модификация гистоновых и негистоновых белков.


В ядре отрицательно заряженная ДНК находится в комплексе с положительно заряженными белками гистонами. Чтобы начались матричные синтезы, нужно «снять» гистоны с ДНК. Это достигается путем ведения отрицательно заряженных структур (под действием гормонального сигнала посредством ферментов аденилатциклазы (превращает АТФ в цАМФ) и протеинкиназ (катализирует процесс протеин---фосфопротеин) происходит фосфорилирование негистоновых белков, которые при этом приобретают отрицательный заряд и притягивают к себе положительно заряженные гистоны. В результате чего ДНК обретает способность к транскрипции и дальнейшей трансляции.


5. Строение иммуноглобулинов (Ig). Характеристика основных классов Ig - (IgA, IgD, IgE, IgG, IgM). Регуляция экспрессии генов Ig и причины их разнообразия.

Все молекулы иммуноглобулинов состоят из 2 идентичных легких (L) цепей (молекулярная масса 23000) и 2 идентичных тяжелых (H) цепей (молекулярная масса 53,000-75,000) связанных в форме тетрамера (L2H2) дисульфидными мостиками.


Строение иммуноглобулинов (Ig).

В каждой цепи можно выделить специфические домены, или области, характеризующиеся структурными и функциональными особенностями. Аминокислотная последовательность С-концевого отдела цепи легкой цепи (108-214 аминокислотный остаток) постоянная (константная) –СL-область. N-концевой отдел легких цепей (1-107 –й аминокислотный остаток) вариабельная (меняющаяся ) VL-область цепи. Одна четверть тяжелых (H) цепей (около 120 аминокислот) со стороны N -концевой аминокислоты названа переменной (вариабельной) областью (VH), а остальная часть тяжелой цепи (свыше 300 аминокислот) состоит из нескольких константных областей (CH1, CH2, CH3). N-концевые вариабельные участки легких (VL) и тяжелых(VH) цепей молекулы иммуноглобулина формируют домен молекулы, который связывает специфический антиген – активный центр антитела.


Характеристика основных классов Ig - (IgA, IgD, IgE, IgG, IgM).


Исследования аминокислотного состава СН областей тяжелых цепей у людей позволило выделить пять типов тяжелых цепей обозначенных -, -, - ,- и , имеющих молекулярную массу от 50 000 до 70 000. Тип Н цепей определяет класс иммуноглобулина и его функциональные особенности. Выделяют 5 классов иммуноглобулинов: IgG, IgA, IgM, IgD и IgЕ. Структурные особенности СН областей тяжелых цепей позволяет в каждом классе выделить отдельные подклассы иммуноглобулинов.


Регуляция экспрессии генов Ig и причины их разнообразия.


Каждый человек способен к образованию антител, направленных против возможно более миллиона различных антигенов. Порождение такого огромного разнообразия антител зависит от комбинаций различных структурных генов, способствующих формированию каждой цепочки иммуноглобулина и высокой частоты соматических мутационных событий в перестраиваемых генах VН и VL.

Рассмотрим этот вопрос на примере рекомбинации генов, кодирующих тяжелые цепи. В ДНК лимфоцитов содержаться гены константных областей пяти классов и гены вариабельных областей трех типов: 300-400 разных генов V, около 20 разных генов D и 4 разных гена J. Эти группы генов расположены в разных участках ДНК. В результате транспозиции происходит объединение трех разных генов V, D и J в полный ген вариабельной области цепи Н. При этом выбор каждого гена из группы соответствующих генов происходит случайно: любой ген Vi из сотен генов V может оказаться объединенным с любыми генами Di и Ji из групп соответственно D и J. Далее, также путем транспозиции, полный ген вариабельной области может объединиться с любым из генов константной области, в результате получается полный ген соответствующей Н-цепи. Общее число вариантов полного гена Н-цепи равно примерно 4000. Сходным путем образуются и гены легких цепей; их тоже может быть около 4000 вариантов. При образовании иммуноглобулинов цепи Н и L могут соединяться в разных сочетаниях, поэтому общее число разных иммуноглобулинов достигает порядка 107 (4000*4000=1,6*107).

Поскольку распределение генов при транспозиции имеет случайный характер, в разных лимфоцитах образуются разные сочетания генов V, D, J и С в полном гене иммуноглобулиновой цепи, т.е. происходит дифференциация лимфоцитов и образование клонов, различающихся генотипически. Соответственно, они различаются и фенотипически – по способности синтезировать антитела определенной специфичности.


Регуляция экспрессии генов Ig:


Для многих регуляторных белков биосинтез ограничен клетками строго определенных типов. Например, октамерсвязывающий белок Oct-2 , участвующий в активации экспрессии генов иммуноглобулинов в B-лимфоцитах, обнаруживают только в клетках, синтезирующих иммуноглобулины. Экспрессия рекомбинантного гена, кодирующего Oct-2, в клетках HeLa приводит к активации экспрессии генов иммуноглобулинов на уровне транскрипции. Таким образом, для осуществления тканеспецифической регуляции экспрессии генов в этом примере необходим тканеспецифический синтез белка-активатора транскрипции.


6. Патология белкового обмена. Нарушение переваривания и всасывания, последствия ахилии. Белковое голодание, квашиоркор, их последствия и основные проявления. Биосинтез дефектных белков. Первично - и вторично-дефектные белки. Относительно патологические белки. Поврежденные белки.


Патология белкового обмена.


В организме практически нет депо белков. Источником аминокислот для их синтеза служат компоненты пищи. При нарушении переваривания и всасывания белков развивается алиментарная белковая недостаточность. Нарушения белкового обмена возможны на всех этапах, начиная с всасывания и заканчивая выведением из организма конечных продуктов обмена. Кроме того, при повреждении генетического аппарата изменяется синтез белков или синтезируются белки с измененной структурой.


Нарушение переваривания и всасывания, последствия ахилии.


При заболеваниях пищевода и кишечника (рак пищевода, непроходимость пищевода или кишечника и т.д.) возникает проблема введения белков в организм. Введение белков парэнтерально, т.е. минуя желудочно-кишечный тракт, вызывает сенсибилизацию организма, а при повторном введении может развиться анафилаксия. Для предотвращения указанных реакций принято вводить парэнтерально (минуя ЖКТ) смеси аминокислот, которые не обладают специфичностью и их можно долго применять без значительных осложнений.

Кроме того проблемы с пищеварением белков могут возникнуть на стадии переваривания в желудке из-за уменьшения секреции либо отсутствия секреции соляной кислоты. Ахилия (Achylia) - отсутствие секреции HCl. Данный термин применяется обычно по отношению к желудку, не вырабатывающему желудочный сок - желудочная ахилия (achylia gastrica), вследствие атрофии его слизистой оболочки. Отсутствие HCl может обуславливать процессы бактериального гниения в кишечнике, в результате чего иногда возникает диарея.

Из-за хронического энтерита (хроническое воспалительное заболевание тонкой кишки) развивается гипопротеинемия. Ее наличие объясняется не только нарушением гидролиза белков и всасывания аминокислот кишечной стенкой, но и повышенной экссудацией белков, в основном альбуминов, в просвет кишки при ее воспалительных поражениях.


Белковое голодание, квашиоркор, их последствия и основные проявления.


В настоящее время идентифицировано более 200 различных белков в плазме клеток крови, биологических жидкостей и тканей. Это позволяет понять, почему дефицит белка дает многочисленные дефекты.

Следствием белкового голодания является белковая недостаточность, которая может быть следствием не только дефицита белка, но и ряда заболевания, на фоне достаточного поступления белка с пищей. Белковая недостаточность развивается как при наличии, и при частичном голодании, а также при приеме однообразного белкового питания, когда в диете преобладают белки растительного происхождения. Результатом этого является развитие гипоальбуминемии, нарушение осмотического давления (вследствие дефицита альбуминов, которые связывают воду). Осмотическое давление при этом падает, и жидкость уходит в ткани, вызывая отеки. Такой формой пищевой дистрофии при белковой патологии является квашиоркор. Заболевание распространенно в развивающихся странах. Причина квашиоркора - дефицит белков в пище. Новорожденный ребенок до 3-х летнего возраста вскармливается только молоком матери, потом потребляет низкобелковую диету (вода, рис, фрукты). В результате уровень поступающего в организм белка снижен, снижается соответственно уровень и активность протеаз, вследствии этого белок плохо усваивается. Белки необходимы организму как главные пластические элементы, поэтому при квашиоркоре наблюдается остановка роста, атония мышц, нарушения репарации и регенерации почки, почка имеет вид красной корочки, как после ожога.

Т.к. белки необходимы для образования транспортных форм липидов (ЛП), то их дефицит приводит к дефициту синтеза ЛП и нейтральный жир (ТГ) накапливается в ткани, вызывая жировую дегенерацию.

Белок необходим для синтеза гемоглобина, и дефицит белка проявляется в виде анемии.

Белки необходимы для иммунологической защиты, их дефицит приводит к развитию вторичного иммунодефицита.

Одним из более ранних нарушений азотистого обмена при белковой недостаточности является резкое снижение интенсивности дезаминирования, трансаминирования и биосинтеза аминокислот, а также биосинтеза мочевины. Эти нарушения обусловлены недостаточным синтезом белковой части ферментов, катализирующих эти реакции. Исключение составляет аргиназа, активность которой не нарушается. Следствием этих нарушений является увеличение концентрации а/к в крови (до 10-25%, в норме 1-2%) и уменьшении концентрации мочевины.

При белковой недостаточности отмечены также специфические изменения обмена отдельных а/к. В частности нарушения обмена ТРП (триптофана) сопровождается накоплением ксантуреновой кислоты, которая оказывает токсическое действие на бета-клетки островков Лангерганса pancreas, являясь тем самым одним из этиологических факторов диабета.


Биосинтез дефектных белков.


Измененный синтез белков может быть результатом


Первично - и вторично-дефектные белки.


Все патологические белки делятся на 2 группы.

  1. Первично – патологические синтезированы за счет дефектного генома:

  1. Вторично – патологические: возникают благодаря постороннему воздействию:

Кроме дефектов белков - ферментов могут возникать дефекты белков неферментной природы: индивидуальных белков плазмы ( альбуминов, ЛП), белков системы свертывания крови, Hb, Ig, белков комплемента, калликреин-кининовой системы.


4. ПРАКТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ ЗАНЯТИЯ

Лабораторная работа:

1. Определение общего белка сыворотки крови рефрактометрическим методом.

Грицук А.И. Практическая биохимия: Учебное пособие. ч.1. – Гомель, 2002. – С. 88–93.

5. ХОД ЗАНЯТИЯ.

5.1 Проведение устного теоретического опроса.

5.2 Проведение письменного контроля по теоретическим знаниям.

5.3 Выполнение лабораторной работы.

5.4 Выводы по лабораторной работе. Подведение итогов.

Лабораторная работа №1: Определение общего белка сыворотки крови рефрактометрическим методом.

ПРИНЦИП МЕТОДА: В основе рефрактометрии лежит различная преломляющая способность жидких сред, количественно выражаемая коэффициентом преломления (отношение синуса угла падения () к синусу угла преломления ():

Sin

n = ,

Sin


который в сыворотке крови обусловлен в основном количеством, качеством растворенного белка и температурой. Влияние других компонентам сыворотки крови на коэффициент преломления значительно меньше. Определение коэффициента преломления проводят с помощью рефрактометров.

Содержание белка (%) в плазме (сыворотке) крови

Коэффициент преломления

Содержание белка (%)

Коэффициент преломления

Содержание белка (%)

1,33705

0,63

1,34575

3,68

1,33743

0,86

1,34612

5,90

1,33781

1,08

1,34650

6,12

1,33820

1,30

1,34687

6,34

1,33858

1,52

1,34724

6,55

1,33896

1,74

1,34761

6,77

1,33934

1,96

1,34798

6,98

1,33972

2,18

1,34836

7,20

1,34000

2,40

1,34873

7,42

1,34048

2,62

1,34910

7,63

1,34086

2,84

1,34947

7,85

1,34124

3,06

1,34984

8,06

1,34162

3,28

1,35021

8,28

1,34199

3,50

1,35058

8,49

1,34237

3,72

1,35095

8,71

1,34275

3,94

1,35132

8,92

1,34313

4,16

1,35169

9,14

1,34350

4,38

1,35205

9,35

1,34388

4,60

1,35242

9,57

1,3442

4,81

1,35279

9,78

1,34463

5,03

1,35316

9,99

1,34500

5,25

1,35352

10,20

1,34537

5,47

1,35388

10,41


РАСЧЕТ: Определив показатель преломления по таблице, вычисляют процент содержания белка в сыворотке крови; для перехода к единицам системы СИ (г/л) результат следует умножить на 10.

НОРМА: содержание общего белка в плазме (сыворотке) крови здорового человека составляет 6.5-8.5 % или 65-85 г/л.




6. ВОПРОСЫ ДЛЯ САМОКОНТРОЛЯ ЗНАНИЙ

1 Активация аминокислот происходит с помощью фермента:

а) лигазы; б) фосфатазы; в) РНК-азы; г) пептидазы; д) синтетазы; е) лиазы?

2 Аминокислоты в белках ковалентно связаны:

а) силами Ван-дер-Ваальса;

г) фосфоэфирными связями;

б) пептидными связями;

д) водородными связями;

в) гидрофобными связями;

е) координационными связями?

3 Какие белки узнают терминирующие кодоны мРНК:

а) факторы освобождения;

в) факторы элонгации;

б) ферменты рестрикции;

г) CAP-связанные белки?

4 Характерной чертой рибосом эукариот является:

а) наличие двух субъединиц – 30 и 50 S;

г) присутствие ДНК;

б) наличие двух субъединиц – 40 и 60 S;

д) наличие фосфолипидов;

в) высокая АТФазная активность;

е) наличие гистонов?

5 Точковая мутация мРНК будет наиболее вероятной причиной:

а) распада мРНК; б) инактивации рибосом; в) изменения первичной структуры белка; г) незавершенной транскрипции; д) подавления сплайсинга?

6 Внутривенное введение радиоактивной меченой аминокислоты взрослому животному приводит:

а) к инкорпорации эквивалентных количеств меченой аминокислоты во все белки организма; б) инкорпорации различных количеств меченой аминокислоты в отдельные белки организма; в) меченая аминокислота не инкорпорируется в белок; г) быстрой и полной экскреции меченой аминокислоты; д) вытеснению и экскреции равного количества немеченной аминокислоты?

7 Белки синтезируются:

а) от N-конца к С-концу;

г) с матрицы иРНК;

б) от С-конца к N-концу;

д) от 3’-конца к 5’-концу РНК;

в) с матрицы рРНК;

е) от 5’-конца к 3’-концу РНК?

8 Основные каталитические функции в рибосоме осуществляют:

а) факторы инициации; б) факторы элонгации; в) факторы терминации; г) р-РНК; д) синтетазы; е) рибосомальные белки?

9 Каждая рибосома в полисоме:

а) движется по мРНК в направлении 3` 5`; б) движется по мРНК в направлении 5` 3`; в) синтезирует многие полипептидные цепи; г) синтезирует только одну полипептидную цепь; д) диссоциирует по окончании синтеза; е) подавляется актиномицином D?

10 Укажите основной фермент, ответственный за реализацию информации генома ретровирусов:

а) ДНК-лигаза; б) ДНК-полимераза; в) обратная транскриптаза (ревертаза); г) РНК-полимеразы; д) АРС-аза?

11 Какая из нуклеиновых кислот в животной клетке отличается большей стабильностью:

а) мРНК; б) рРНК; в) ДНК; г) мяРНК; д) предшественники тРНК; е) гяРНК?

12 Денатурированная ДНК лимфоцитов человека не будет гибридизироваться:

а) с рРНК лимфоцитов;

в) денатурированной ДНК митохондрий;

б) тРНК почки;

г) мРНК мозга?

13 Дифтерийный токсин подавляет биосинтез белка на этапе и путем:

а) инициации; б) элонгации; в) терминации; г) процессинга иРНК; д) сплайсинга иРНК; е) рибозилирования ФЭ-2; ж) ограниченного протеолиза; з) аденилирования белка; и) метилирования белка; к) фосфорилирования белка?


7. ЛИТЕРАТУРА

Основная

  1. Материал лекций.

  2. Биологическая химия: учебник/ В.К Кухта., Т.С.Морозкина, и др ; под ред. А.Д.Тагановича.- Минск: Асар, М.: Издательство БИНОМ, 2008. С. 387-418

  3. Березов Т. Т., Коровкин Б. Ф. Биологическая химия. М.: Медицина, 1990. С. 354–364; 1998. С. 509–544.

  4. Николаев А. Я. Биологическая химия. М.: Высшая школа, 1989. С. 92–156.

Дополнительная

  1. Марри Р. и др. Биохимия человека. М.: Мир, 1993. Т. 2, С. 94–126, 321–325.

  2. Филиппович Ю. Б. Основы биохимии. М.: Высшая школа, 1993. С. 272–297.

  3. Албертс Б. и др. Молекулярная биология клетки. М.: Мир, 1994. Т. 2. С. 176–253.

  4. Ленинджер А. Основы биохимии. М.: Мир, 1985. Т. 3. С. 926–994.

  5. Троицкий В. Г. Дефектные белки – постсинтетическая модификация. Киев: Наукова думка, 1991. С. 48–226.


Методическая разработка составлена асс. каф. биохимии Громыко М.В.